Болезнь Альцгеймера — самая распространенная нейродегенерация, которая затрагивает все больше людей по всему миру. Несмотря на пристальное внимание ученых, полностью понять ее патогенез и создать хотя бы одно эффективное лекарство до сих пор не удалось. Это связано со сложностью и разнообразием процессов в мозге заболевшего. Одно из самых перспективных направлений в этой области — изучение изменений тау-белка. Эта молекула в норме стабилизирует микротрубочки нейронов, но при болезни Альцгеймера и других таупатиях отходит от них и образует разнообразные патологические скопления внутри нейронов. В недавней статье японских нейробиологов описан новый механизм, объясняющий ранние этапы патологии тау-белка. Он предполагает, что сначала за счет жидкостного разделения фаз формируются капли (жидкие включения) тау-белка, которые затем переходят в твердые и устойчивые формы, — затравки, распространяющие патологические изменения по мозгу.
Население Земли в глобальном масштабе стремительно стареет. Согласно прогнозам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), уже к 2030 году каждый шестой человек окажется старше 60 лет, а к 2050 году их число превысит два миллиарда. Это означает также рост бремени ассоциированных с возрастом болезней: сердечно-сосудистых, атеросклероза, диабета II типа, рака, нейродегенераций и так далее. Среди нейродегенеративных заболеваний особенно распространена болезнь Альцгеймера, с которой связано 65% всех случаев деменции. Сейчас в мире такой диагноз имеют 44 миллиона человек, а в ближайшие десятилетия их число может возрасти в разы (M. Orlov, 2019. Alzheimer's disease therapy: challenges and perspectives). Существенно, что при используемых сейчас методах диагностики многие случаи нейродегенерации остаются невыявленными и в действительности число заболевших скорее всего намного больше.
Также болезнь Альцгеймера связана с огромными финансовыми затратами, прежде всего на уход за больными. Поэтому неудивительно, что во многих странах значительные усилия и средства тратятся на попытки понять механизмы ее развития и создание лекарства (см., например, Пересадка крысам кишечной микрофлоры больных Альцгеймером вызвала у них симптомы этой болезни, «Элементы», 02.11.2023). К сожалению, успехи невелики: ни одного действующего на причину болезни (патогенетического) метода лечения не существует. Все назначаемые пациентам лекарства лишь на время облегчают симптомы и потому болезнь быстро приводит к инвалидизации и неизбежной смерти.
Мы уже многое знаем о патогенезе болезни Альцгеймера и других нейродегенераций, но, как правило, не всё и далеко не самое важное. Плачевное состояние таких исследований во многом связано с тем, что они в свое время «повернули не туда». Целые десятилетия преобладала гипотеза амилоидного каскада, которая отводит решающую роль в развитии нейродегенерации бета-амилоиду. Это небольшой фрагмент мембранного белка APP, который склонен слипаться в агрегаты в межклеточной среде. Те, в свою очередь, слагают сенильные бляшки, различимые в мозге под микроскопом. Однако отложения бета-амилоида не коррелируют с тяжестью деменции. Причиной усиленного развития бесперспективного направления исследований во многом стала «амилоидная мафия» во главе с Сильвеном Лесне, который с корыстными целями фабриковал результаты своих работ (В статьях о механизме развития болезни Альцгеймера обнаружены систематические фальсификации, «Элементы», 17.09.2022).
Разумной альтернативой выглядят работы, которые считают первопричиной болезни Альцгеймера патологию тау-белка (рис. 2). Она коррелирует с тяжестью симптоматики и, по-видимому, служит «спусковым крючком», начинающим прочие нарушения в мозге. В том числе — изменения состояния бета-амилоида, а в конечном счете — массовую гибель нейронов. Обе молекулы — тау-белок и бета-амилоид — взаимодействуют между собой, имеют свойства прионов и «заражают» другие белки своей неправильной трехмерной формой (O. Tatarnikova et al., 2016. Beta-Amyloid and Tau-Protein: Structure, Interaction, and Prion-Like Properties). Важно, что тау-белок участвует в развитии не только болезни Альцгеймера, но и целого ряда других таупатий. Это группа нейродегенераций включает в себя также болезнь Пика, прогрессирующий супрануклеарный паралич, фронтотемпоральную деменцию и паркинсонизм 17 хромосомы и так далее. Эти болезни отличаются симптоматикой, локализацией повреждений в мозге, участвующими разновидностями тау-белка и другими признаками.
Тау-белок (или ассоциированный с микротрубочками белок тау, microtubule-associated tau-protein, MAPT) в норме стабилизирует клеточный скелет нейронов. Он связывает димеры тубулина — основного структурного белка микротрубочек — и управляет их динамикой, то есть ростом и разрушением (рис. 3). Однако при начале нейродегенерации тау-белок переходит в гиперфосфорилированную форму — к определенным аминокислотным остаткам его последовательности присоединяется множество остатков фосфата. Это меняет свойства белка, заставляя тау «выпустить» микротрубочки. Те в результате начинают распадаться, что нарушает транспорт в аксонах, для которых микротрубочки служат опорой и главной «магистралью для перевозок». Между тем сам гиперфосфорилированный тау-белок образует все более крупные скопления: сначала олигомеры из двух и более молекул, затем другие переходные формы, более крупные нитевидные фибриллы и, наконец, нейрофибриллярные клубки или скручивания (neurofibrillary tangles, NFT), видимые в микроскоп. По современным представлениям, следом присоединяется патология бета-амилоида, нарушения аутофагии и различные негативные изменения, которые приводят к гибели нейронов. Остается неясным, что именно происходит с тау-белком на самой ранней стадии болезни, а также как он формирует скопления (агрегаты) с разными свойствами и влияет на состояние клетки.
Патологические изменения передаются между клетками мозга подобно эпидемии — за счет прионоподобных свойств тау-белка и бета-амилоида, через прямые контакты между нейронами и опосредованно за счет других механизмов, а также изменений на тканевом уровне (подробнее см. J. Vogel et al., 2020. Spread of pathological tau proteins through communicating neurons in human Alzheimer’s disease).
Важным вкладом в понимание инициирующих болезнь Альцгеймера изменений тау-белка стала новая статья в журнале Structure. Ученые из Японии использовали метод получения химерных (гибридных) белков на основе тау и оптогенетику, то есть манипуляции молекулами и клетками с помощью света. С их помощью ученые показали, что тау-белок сперва образует жидкие «капли», которые затем переходят в состояние устойчивых твердых гранул, служащих затравками для распространения патологических изменений белка. В работе использован рекомбинантный, то есть полученный с помощью биоинженерии белок тау с мутацией P301L (замена пролина на лейцин в положении 301). Такая мутация вызывает развитие специфической таупатии — фронтотемпоральной деменции и паркинсонизма 17 хромосомы — и связана с повышенной склонностью белка к агрегации. В целом ядро патологических включений — конкретные аминокислотные остатки, из-за которых молекулы тау-белка «слипаются», — специфично для разных болезней. К мутантному тау присоединили CRY2olig. Это тоже белок с измененной последовательностью, который представляет собой криптохром 2 из резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) с заменой E490G (глутаминовая кислота на глицин). Мутация повышает способность цитохрома к олигомеризации под действием синего света.
Переходы от свободных молекул криптохромов к олигомерам и наоборот — это механизм, который позволяет растениям и животным реагировать на изменения освещенности и другие сигналы окружающей среды (см. Возможно, люди способны ощущать магнитное поле, «Элементы», 11.07.2011). Он возник в ходе эволюции очень давно, а сейчас также стал одним из инструментов оптогенетики. Полученный гибридный белок назвали OptoTau. Ранее подобные конструкции уже получали на основе альфа-синуклеина и белка TDP-43, которые связаны с развитием болезни Паркинсона и недавно описанной нейродегенерации LATE-NC (M. Berard et al., 2022. A light-inducible protein clustering system for in vivo analysis of α-synuclein aggregation in Parkinson disease; J. Mann et al., 2019. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43). Под действием синего цвета они успешно образовали локальные скопления с высокой концентрацией, содержащие олигомеры белка.
В обсуждаемой работе OptoTau экспрессировали в культуре клеток мышиной нейробластомы (рис. 4). Вестерн-блот показал, что после воздействия синим светом в течение 24 часов белок перешел в более фосфорилированную форму, — то есть произошло его оптогенетическое «включение». Более того, модификации подверглись именно те аминокислотные остатки, которые фосфорилированы при болезни Альцгеймера. У обычного тау-белка (без мутаций) свет таких изменений не вызвал. Выходит, что «принудительная» оптогенетическая агрегация также стимулировала фосфорилирование тау-белка. Авторы доказали, что эффект не связан с образованием активных форм кислорода (АФК) под действием света.
Далее авторы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание, которое выявило внутриклеточную локализацию гибридного белка. Как и следовало ожидать, после освещения синим OptoTau мигрировал к альфа-тубулину (белок микротрубочек) и концентрировался вокруг ядра. Без оптогенетической активации OptoTau распределялся по всей клетке однородно. Такие возникшие под действием синего света скопления белка авторы сравнивают с агресомами (aggresome, см. также Война и мир: как устроить белковую жизнь?). Это своеобразные «клетки» из белка виментина, которые образуются у центросомы — органеллы, которая обеспечивает работу микротрубочек клетки и ее деление. Агресомы появляются, когда образуется слишком много неправильно свернутых белков (имеющих патологическую форму) и другие защитные системы — шапероны, система убиквитинилирования-протесом и лизосом/аутофагии — перестают с ними справляться. Именно такое засилье патологических (неправильно свернутых) белков характерно для различных нейродегенераций. Они однонаправленно (то есть ретроградно) транспортируются по микротрубочкам к агресомам, где хранятся или разрушаются.
Таким образом, для работы агресом необходимы микротрубочки. Поэтому чтобы выяснить их роль в патологии тау-белка, далее ученые обратимо ингибировали сборку микротрубочек с помощью нокодазола в тех же клетках, содержащих OptoTau и под синим освещением. Ингибитор не помешал фосфорилированию гибридного белка и связанному с ним образованию олигомеров. Флуоресцентная микроскопия показала, что OptoTau имел гранулярную форму (состоял из мелких включений) и был локализован не только у ядра, но и по всей цитоплазме, но не в области центросомы. Выходит, из-за нарушения структуры микротрубочек нокодазолом агресомы не возникали, а OptoTau скапливался в виде каких-то других немембранных структур в цитоплазме. Когда те же клетки убрали из-под действия синего света, количество гранулярных скоплений OptoTau сильно уменьшилось. Это подтверждает, что действие нокодазола на микротрубочки является обратимым.
Чтобы отличить жидкие скопления белка от стабильных белковых агрегатов в твердом состоянии (включая фибриллы), авторы использовали спирт 1,6-гександиол. Известно, что он растворяет только белковые включения первого, но не второго типа. Возникшие на синем свету гранулы OptoTau полностью исчезли после воздействия 1,6-гександиола в течение часа. В то же время лаурилсаркозинат натрия не повлиял на состояние OptoTau. Лаурилсаркозинат натрия (саркозил) — это анионный детергент, который используют для выделения фракции нерастворимого в нем белка тау, имеющего форму филаментов и, по-видимому, важного для развития нейродегенерации. В данном случае растворимого в саркозиле OptoTau в клеточных лизатах оказалось очень мало. Из всего этого следует, что «включенный» синим светом OptoTau формирует именно белковые капли, которые не имеют мембранной упаковки и не являются фибриллами. Это происходит при нарушении динамики микротрубочек, однако только его недостаточно для образования стабильных агрегатов тау-белка.
Известно, что у трансгенных мышей с мутациями в гене MAPT при старении чаще происходит делеция в N-концевом домене тау-белка. Поэтому авторы решили выяснить, как их модель сработает на таких «усеченных» патологических молекулах. Для новой версии OptoTau был использован тау-белок без фрагмента на N-конце последовательности — конструкцию назвали OptoTau-ΔN. Как и ожидали авторы исследования, новый гибридный белок на синем свету сильнее фосфорилировался и быстро формировал олигомеры. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что на синем свету экспрессирующие OptoTau-ΔN клетки содержат больше нерастворимого в саркозиле тау-белка (по сравнению с OptoTau-клетками). Таким образом, усеченный гибридный белок агрегирует быстрее. Наличие в образованных им включениях бета-структур подтвердили с помощью избирательного красителя тиофлавина S. Скопления OptoTau-ΔN сохраняли стабильность после выключения света и при добавлении 1,6-гександиола. Это отличает их от жидких капель тау-белка («тау-капель»), которые при таких условиях разрушаются. Таким образом, делеция на N-конце тау-белка приводит к усиленному взаимодействию его молекул между собой, благодаря которому нестойкие тау-капли превращаются в стабильные белковые агрегаты.
Чтобы отличить жидкие скопления OptoTau-ΔN от его твердых агрегатов, ученые далее обратили внимание на изменения их формы со временем. Дело в том, что форма капель жидкости определяется поверхностным натяжением, поэтому они довольно быстро приобретают округлую форму. Для твердых агрегатов белка такое нехарактерно. Авторы доказали, что тау-капли действительно возникают раньше твердых включений (гранул) тау-белка. Далее лизаты клеток изучали с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы. Метод применяют для разделения на отдельные фракции тау-белка с его выраженным полиморфизмом, то есть множеством разновидностей с разными свойствами, возникающих из-за альтернативного сплайсинга и посттрансляционных модификаций. Оказалось, что в экспрессирующих OptoTau-ΔN клетках под действием синего света сильно возросла доля небольших по размеру и средних гранул тау-белка. В то же время свободного тау-белка и фибрилл не прибавилось.
Ранее стало известно, что переход агрегатов тау-белка в зрелую твердую форму связан с лизосомами. Поэтому авторы изучили состояние этих органелл в обоих типах клеток — экспрессирующих OptoTau (который образует только капли) и OptoTau-ΔN (который образует капли, далее переходящие в нерастворимые агрегаты). В первом случае белковые капли располагались рядом с лизосомами (различимыми благодаря специфическому маркеру LAMP1), но не все — значительная часть была распределена по цитоплазме. Во втором случае все капли из OptoTau-ΔN были локализованы вблизи лизосом, что означает их эффективную транспортировку к ним. При этом прилегающие к скоплениям белка органеллы оказались увеличены, что указывает на их разрушение.
В ходе нейродегенерации патологические изменения «растекаются» по мозгу, повреждая все новые его структуры. С этим связано и распространение патологических (неправильно свернутых) форм белков. Считается, что перенос патологии тау-белка в новые области мозга обеспечивают крупные агрегаты из фосфорилированного тау-белка. В новой работе при одновременном воздействии синего света и нокодазола таких форм белка стало больше. Более того, лизат выдержанных на синем свете клеток заметно усилил агрегацию синтетического тау-белка в экспериментах in vitro и увеличил в его молекулах число характерных бета-структур.
Таким образом, в обсуждаемой работе предложен новый механизм агрегации тау-белка, который может лежать в основе таупатий. Она служит альтернативой другим исследованиям, стремящимся объяснить, как нормально функционирующий белок превращается в молекулу-затравку для распространения нейродегенерации. Согласно авторам статьи, тау-белок сперва образует промежуточные жидкие скопления (капли) по механизму жидкостного разделения фаз (liquid-liquid phase separation, LLPS) и лишь затем переходит в твердую стабильную форму, запускающую прочие патологические изменения.
Жидкостное разделение фаз в клетке привлекает все большее внимание биологов. Суть феномена — самопроизвольное формирование границ раздела между двумя областями клетки, наподобие той, что образуется между жидкостью и ее газом или кристаллической формой. Однако в этом случае обе фазы находятся в одном агрегатном состоянии (жидкость), но сильно отличаются по физико-химическим свойствам. Жидкостное разделение фаз объясняет существование немембранных органелл (биомолекулярных конденсатов или капель) в клетке, которые в отличие от «классических» мембранных органелл не отделены от цитоплазмы упаковкой из липидов. Тем не менее такие органеллы поддерживают свою целостность, особый состав и в то же время могут свободно обмениваться молекулами с окружающей средой. Это отличает их от мембранных органелл, в случае которых такой транспорт строго ограничен и может привести к опасным последствиям. Например, «убежавший» из митохондрий цитохром c запускает апоптоз (B. Wang et al., 2021. Liquid–liquid phase separation in human health and diseases).
Исследования таких «неклассических» органелл — очень молодая, но динамично развивающаяся область. Последние два десятилетия биологи активно изучают так называемые стресс-гранулы (stress-granules) и p-тельца (тельца процессинга, p-bodies). Первые состоят из белка и РНК и, как следует из названия, активно образуются в клетке при определенных стрессовых условиях. По-видимому, они защищают РНК от разрушения либо регулируют ее активность, однако в точности функции стресс-гранул пока неизвестны. P-тельца образованы ферментами, которые участвуют в метаболизме мРНК. Скорее всего, они обеспечивают ее разрушение или хранение — это также предстоит уточнить в будущем. Обе немембранные органеллы имеют много общего, но отличаются по функциям.
Немембранные органеллы явно играют важную роль при развитии заболеваний, прежде всего нейродегенераций. Это значит, что они могут помочь создать новые способы лечения. Совсем недавно была описана очередная такая органелла — BAG2 (Bcl2-associated athanogene 2). Она очень похожа на стресс-гранулу или p-тельце, содержит специфические белки, но не РНК. BAG2 активируется в ответ на другие типы стресса, в частности при повышенном осмотическом давлении. Наряду с другими системами протеостаза — поддержания белков клетки в должном состоянии — новая органелла уничтожает сомнительные белки, а также способствует работе шаперонов (молекул, помогающих белкам сохранять правильную структуру).
Обсуждаемое исследование продолжает тренд и описывает, как жидкостное разделение фаз способствует переходу тау-белка в затравочную форму и тем самым развитию нейродегенерации. Работа также подтверждает важную роль агресом — структур-«тюрем», в которых заперты и готовятся к разрушению патологические белки. Это новое направление исследований нейродегенераций, которое кажется перспективной альтернатива прежним подходам. К сожалению, те оказались бесплодными и не смогли удовлетворительно объяснить механизм развития нейродегенерации и стать основой для создания лекарства. Остается надеяться, что в будущем исследования белковых капель и немембранных органелл приведут к прогрессу биомедицины — не только в работах по нейродегенеративным заболеваниям, но и, например, по онкологии.
Источник: Yoshiyuki Soeda, Hideaki Yoshimura, Hiroko Bannai, Riki Koike, Isshin Shiiba, Akihiko Takashima. Intracellular tau fragment droplets serve as seeds for tau fibrils // Structure. 2024. DOI: 10.1016/j.str.2024.06.018.
Михаил Орлов
Свежие комментарии