НОВЫЙ ВИРУС С КОРОНОЙ

Коронавирус, похоже, становится надёжным источником новостей под грифом «мы все умрём». В 2002 году весь мир закошмарили «атипичной пневмонией» из Китая (SARS), вызванной новым видом коронавируса, а в 2012 году в Саудовской Аравии обнаружили ещё более опасный MERS. И если SARS с его уровнем смертности 10% самоликвидировался в 2004-ом (8000 выявленных случаев и 800 смертей), то смертельный в 35% случаев MERS до сих пор циркулирует на Ближнем Востоке (всего диагностировано около 2250, около 800 погибли).

Но MERS уже набил оскомину и новостей на нем не пожаришь. И вот Китай — кузница новых вирусов, переходящих от диких млекопитающих к человеку — преподносит нам новый коронавирус, который так и окрестили 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV).


Коронавирус под электронным микроскопом
Итак, знакомимся поближе.

К настоящему времени зарегистрировано 1372 лабораторно подтверждённых случаев нового коронавируса 2019-nCoV, который в некоторых СМИ уже успели окрестить аббревиатурой CARS (China Acute Respiratory Syndrome) по аналоги с SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome). Действительно, новый вирус наиболее родственен коронавирусу SARS-CoV и тоже происходит из Китая.

Первые сообщения о вспышке новой коронавирусной инфекции появились 31 декабря 2019 года, хотя сегодня известно, что началась она с обнаружения в середине декабря 2019 года в городе Ухань провинции Хубэй центрального Китая первых случаев пневмонии неизвестного происхождения у местных жителей, связанных с рынком животных и морепродуктов Хуанань. Симптомы болезни у всех больных появились между 8 декабря 2019 года и 2 января 2020 года. 7 заражённых были классифицированы как тяжело больные. 11 января скончался 61-летний пациент, а через 4 дня от последствий вирусной инфекции умер второй больной, 69-летний мужчина. От больных, в том числе от умерших, был выделен новый вариант уже известного нам коронаровируса или Вирус 2019-nCoV, который до сих пор не передавался людям.

В ближайшие дни и недели новый вирус, вероятно, продолжит распространяться и будет узнаваться всё больше и в большем количестве стран. К настоящему моменту вирус вывезен с туристами из Уханя за пределы Китая уже в Таиланд, Юж. Корею, Австралию и Францию.



ОТКУДА ОН ПРОЯВИЛСЯ?

Такие вирусы обычны у местных летучих мышей, но на людей они переходят крайне редко, обычно через звено промежуточных хозяев (для SARS были заподозрены китайские виверры, а в случае MERS это одногорбые верблюды) Тем не менее, время от времени такие переходы происходят, чему особенно способствует скученность населения и его тесный контакт с дикими и домашними млекопитающими. Далее эти новые для человека коронавирусы могут мутировать так, что начинают передаваться не только от животных, но и от человека к человеку.

НАСКОЛЬКО ОН ОПАСЕН?

Сразу замечу, что эти, выявленные в последние 20 лет, три коронавируса по людям передаются с большим трудом и только при тесном контакте, да и далеко не все способны ими заразиться. Потому SARS самоискоренился, а все новые случаи MERS связаны с Ближним Востоком и контактам с верблюдами, оставаясь завозными за пределами первичных очагов.

По информации ВОЗ среднее количество людей, которые могут заразиться от одного больного 2019-nCoV-инфекцией составляет 1,4-2,5 (для сравнения: корь – 12-18, краснуха – 5-7, полиомиелит – 5-7). Однако, к счастью, новый вирус гораздо менее патогенен и летален, чем SARS и тем более MERS — к настоящему времени из 1372 выявленных больных скончалось порядка 60 человек, в основном пожилых людей. Таким образом, велика вероятность что новый вирус по опасности не шибко превосходит сезонный грипп.

Вообще же коронавирусы — это одни из возбудителей сезонных ОРВИ (ОРЗ по-старому), открытые ещё в 1965 году. Четыре вида коронавирусов (229E, NL63, OC43 и HKU1) вызывают обычные для нас простуды вместе с ещё примерно 200-ми разнообразных респираторных вирусов, включая грипп. Эти коронавирусы проэволюционировали с человеком уже достаточно давно, а потому утратили высокую патогенность.


Фото © https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51249208

СИМПТОМЫ

Новый коронавирус, как и вся его родня, способен поражать слизистую органов дыхания, желудочно-кишечный тракт и нервную систему. Всё зависит от входных ворот. Его первичное размножение происходит чаще всего в слизистой верхних дыхательных путей и тогда возникают гриппоподобные симптомы: обильный насморк, а иногда, чаще у ослабленных детей и пожилых лиц, – бронхиты или пневмонии вплоть до смертельного респираторного дистресс-синдрома и септического шока.

ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ

Специфической терапии, как и для подавляющего большинства вирусных инфекций, нет и вряд ли появится в обозримом будущем. Понятно, что и вакцина отсутствует. И всё же очень обнадёживают современные методы симптоматического лечения и противовирусной химиотерапии (современные ингибиторы вирусных протеаз). В отдельных случаях применяется метод экстракорпоральной мембранной оксигенации. Экспресс-тестов для диагностики в поликлиниках нет и вряд ли появятся, так что подавляющее большинство заразившихся до крутых лабораторий не дойдут и выздоровеют с мыслью, что перенесли обычную простуду.

ЧТО ДЕЛАТЬ?

1) Не паниковать и вообще не впечатляться рраньше времени. Большинству моих читателей не нужно предпринимать ровным счетом ничего.


  • Если вы пожилой человек не самого крепкого здоровья, намеревающийся ехать в китайскую провинцию Хубэй (или в другую область, где может распространяться вирус) — откажитесь от поездки.


  • Если вы побывали в Ухане в последние 2 недели или близко контактировали с кем-то, кто был там с декабря и у вас возникли гриппоподобные симптомы — избегайте контактов с другими людьми и немедленно обратитесь к врачу и обязательно заранее (по телефону) сообщите ему о своей поездке/контакте.

2) Предотвратить респираторную вирусную инфекцию, если вы к ней генетически восприимчивы, не просто, но ВОЗ и CDC рекомендуют стандартные меры профилактики:

  • Если вы всё-таки должны ехать в провинцию Хубэй:

• Избегайте контактов с больными (сопливящими, кашляющими и чихающими) людьми.
• Избегайте контактов с дикими и домашними животными, посещения рынков и употребление в пищу сырого мяса.
• Мойте руки тёплой водой с мылом по 20 сек. Если воды и мыла нет — пользуйтесь спиртосодержащими гелями и салфетками для рук.

Повторяю, что эти меры касаются только тех, кто находится в очаге инфекции в Китае, либо недавно оттуда вернулся, либо контактировал с вернувшимися. Остальных это не касается, живите обычной жизнью.

Избыточное мытье рук или обработка их спиртосодержащими гелями без особой надобности вредны, а ношение медицинских масок бесполезно.



ИТОГОВЫЕ ВЫВОДЫ ДЛЯ ОПТИМИЗМА:

  • Геном вируса уже расшифрован китайскими учёными

  • Вирулентность (заразность) меньшая, чем при ряде других вирусных инфекций

  • Заболевание чаще всего протекает в лёгкой и среднетяжёлой формах, как и обычный грипп

  • Летальность на порядок меньше, чем при MERS или SARS.

  • Многие заболевшие уже полностью выздоровели


Источник ➝

«Загляните, это нечто»: саморепликация искусственной ДНК

«Загляните, это нечто»: саморепликация искусственной ДНК, изображение №1
 

Одной из основных отличительных черт любого живого организма является способность к сохранению и воспроизведению необходимой информации для создания себе подобных. В первую очередь это проявляется в репликации ДНК, когда из одной родительской ДНК появляется пара дочерних, являющихся точной копией своего прародителя. В природе этот процесс наблюдается повсеместно, однако воссоздать его в лабораторных условиях с нуля крайне сложно, тем не менее, вполне реально.

Ученые из института биохимии им.

Макса Планка (Германия) успешно создали биологическую систему, которая обладает способностью к репликации собственного ДНК. Какие методики были применены для создания синтетического реплицирующего ДНК, насколько эффективна полученная система и что данное открытие значит для современной синтетической биологии? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

В области создания искусственных биологических систем способность к репликации являются ключевым аспектом полноценности созданной системы. Достичь этого, по словам ученых, можно посредством реализации базисных составляющих: репликация*транскрипция* и трансляция* ДНК.

Репликация ДНК* — процесс создания из одной материнской ДНК двух дочерних молекул ДНК.
Транскрипция* — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, т.е. процесс переноса генетической информации с ДНК на РНК.
Трансляция* — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице РНК, осуществляемый рибосомой.

Другими словами, чтобы создать полноценную искусственную жизнь, необходимо реализовать самокодированное воспроизведение, т.е. саморепликацию. Это крайне сложный и запутанный процесс.

Авторы исследования отмечают, что в системах, основанных на существующей биохимии, например MPC (minimal protein-based cells), саморепликация требует полного переосмысления молекулярной биологии, включая репликацию, транскрипцию и трансляцию ДНК, с учетом полностью бесклеточной среды.

Синтез белка из ДНК может быть достигнут в определенных рекомбинантных системах на основе фаговых* РНК-полимераз — основных частей механизма трансляции Escherichia coli и системы минимальной регенерации энергии, т.е. PURE — Protein synthesis Using Recombinant Elements (синтез белка с использованием рекомбинантных элементов).

Бактериофаги или фаги* — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки и клетки архей. В биологии применяется в качестве вектора (ДНК для передачи генетического материала внутрь клетки).

Тем временем остается крайне сложным для воссоздания процесс ДНК репликация генома на базе транскрипции и трансляции (TTcDR — transcription–translation-coupled DNA replication), кодирующая все макромолекулярные компоненты системы PURE с помощью самокодируемой реплисомы*.

Реплисома* — мультибелковый комплекс, за счет которого проходит репликация ДНК бактерии.

Помочь реализовать методику TTcDR может ДНК репликация на базе ДНК-полимераз (DNAP) из фагов (например, Phi29).

Однако в методике TTcDR достичь полноразмерного генома Phi29 можно было исключительно путем блокировки части реплицирующих факторов.

Все вышеописанные способы имеют свои теоретические преимущества, однако на практике они не давали полноценного результата. В рассматриваемом нами сегодня труде ученые описывают систему трансляции, которая обеспечивает самокодированную репликацию и экспрессию больших геномов ДНК в четко определенных бесклеточных условиях. В частности, была достигнута саморепликация генома размером более 116 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов), охватывающего полный набор факторов трансляции Escherichia coli (кишечная палочка), все три рибосомных РНК, систему регенерации энергии, а также РНК- и ДНК-полимеразы*.

Полимераза* — фермент, выполняющий синтез полимеров нуклеиновых кислот. ДНК-полимераза синтезирует ДНК, а РНК-полимераза синтезирует РНК. Данный процесс протекает за счет комплементарного копирования родительских ДНК или РНК.

Помимо этого, созданная система продемонстрировала возможность синтезировать более 30 факторов трансляции, половина которых экспрессирует в количествах равных или превышающих вводные.

Результаты исследования

На первом этапе ученые протестировали самокодированный Phi29-DNAP-зависимый TTcDR, используя стандартный протокол системы PURExpress.

Кодирующую область Phi29-DNAP, фланкированную промотором* Т7, сначала клонировали в вектор pCR-Blunt TOPO (pREP, 1a).

Промотор* — последовательность нуклеотидов ДНК, используемая РНК-полимеразой в качестве области для начала транскрипции.
Изображение №1
 
Изображение №1

В теории данная архитектура должна обеспечить спонтанную РНК репликация по типу катящегося кольца* с помощью самокодируемого DNAP без дополнительных белков репликации или предоставляемых извне ДНК-праймеров.

Репликация по типу катящегося кольца* — процесс однонаправленной репликации нуклеиновой кислоты, во время которого происходит быстрый синтез множественных копий кольцевых молекул ДНК или РНК.

Однако, используя стандартную реакцию PURExpress с dNTP (нуклеотид, содержащий дезоксирибозу C5H10O4) и 4 нМ pREP (среда LB с добавлением зеоцина C55H86N20O21S2), обнаружить синтез ДНК не удалось ни с помощью электрофореза в агарозном геле*, ни с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени* (1b и 1c).

Электрофорез ДНК в агарозном геле* — метод разделения фрагментов ДНК по их длине, основанный на определении скорости движения фрагментов разной длины в момент движения в геле под действием внешнего электрического поля.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени* — метод одновременного создания дополнительных копий участков ДНК и измерения количества данной молекулы ДНК.

Чтобы улучшить репликацию ДНК без участия специализированных систем PURE, было решено оптимизировать стандартный протокол реакции PURExpress. Для этого было увеличено относительное количество факторов трансляции, рибосом и восстановителя при одновременном снижении уровней тРНК (транспортная РНК) и rNTP (рибонуклеозид трифосфат) (1d).

Используя этот оптимизированный состав PURE (PURErep), удалось добиться ∼5–12-кратной репликации мономерных звеньев pREP в реакциях TTcDR (1b и 1e). Полноразмерный синтез pREP был подтвержден MluI-расщеплением* продукта репликации (1c).

MluI* является коммерчески доступной эндонуклеазой рестрикции, т.е. ферментом, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В качестве оценочного фактора активности трансляции выступила экспрессия зеленого флуоресцентного белка (sfGFP). Было выявлено, что изменение состава PURE привело к снижению синтеза белка на 20-40% по сравнению с PURE без TTcDR. Тем не менее, такое снижение экспрессии белков остается приемлемым, учитывая улучшение совместимость системы PURErep с репликацией ДНК.

Анализ репликации ДНК на основе qPCR выявил устойчивое время удвоения (1–2 часа) для различных начальных концентраций матрицы, при этом репликация ДНК продолжалась даже через 24 часа при 30 °С (1е).

TTcDR также был устойчив в течение более пяти поколений последовательного разбавления, когда лишь 4% готового продукта реакции PURErep/pREP непосредственно переносили в новую смесь PURErep (1f). Основным выводом данного наблюдения является то, что продукты TTcDR могут служить шаблонами для саморепликации ДНК в течение нескольких поколений.

Ученые отмечают, что для репликации по типу катящегося кольца характерно значительное количество продукта с низкой электрофоретической подвижностью, что и наблюдалось во время опытов. Эти продукты реакции могут быть представлены конкатемерами* с большой молекулярной массой и/или кластерами ДНК/MgPPi.

Конкатемер* — множественные копии ДНК последовательностей, собранные в последовательный кластер.

Также было обнаружено формирование продуктов размером ~ 5 т.п.н. в необработанных образцах. Из этого следует, что реакции TTcDR могут давать значительные количества мономерных копий pREP.

Кроме того, ученым удалось трансформировать продукты E.coli после удаления родительской плазмы. Полученные очищенные продукты реакции были идентичны по размеру с мономерными pREP.

На следующем этапе ученые решили создать набор генов, кодирующих важные компоненты реакции PURE: 31 существенный фактор трансляции (ФТ) бактерии E. coli.

Для этого было проведено исследование TTcDR из pREP (4.6 т.п.н.) в сопряжении с каждой из трех больших плазмид*: pLD1 (30 т.п.н., 13 ФТ), pLD2 (20 т.п.н., 8 ФТ) и pLD3 (23 т.п.н., 9 ФТ). Все они были клонированы для обеспечения рекомбинантной экспрессии 30 из 31 факторов трансляции бактерии E. coli.

Плазмиды* — небольшие молекулы ДНК, способные к самостоятельной репликации.

Продукты TTcDR всех четырех плазмид (включая pREP) демонстрировали идентичные особенности MluI-рестрикции: клональные плазмиды, обычно размножающиеся в E.coli (2a).

Изображение №2
 
Изображение №2

Также стоит отметить, что продукты pLD TTcDR могут быть непосредственно трансформированы в E.coli, где они сохраняются в виде мономерных плазмид.

Модифицированная смесь PURErep также обеспечивала полную репликацию всех трех плазмид pLD вместе с PURErep во время реакции в общей среде (2b).

На этом ученые не остановились и уже на следующем этапе исследования попытались расширить генетическую нагрузку системы TTcDR путем совместной репликации плазмид, кодирующих дополнительные компоненты системы PURE: EF-Tu (pEFTu), которая отсутствует в системе pLD, а также рибосомальный РНК-оперон* rrnB (прРНК прекурсорная рРНК), которая кодирует 23S рРНК (рибосомная РНК), 16S рРНК, 6S рРНК и тРНК (транспортная РНК, в данном случае Glu2) (2c).

Оперон* — функциональная единица генома одноклеточных, в состав которой входят гены, кодирующие белки.

Эксперименты с qPCR, нацеленные на плазмид-специфичные ампликоны*, подтвердили, что мономерные звенья всех шести плазмид (общая длина ДНК составила 93 т.п.н.) реплицировались примерно в 2-8 раз по сравнению с исходным числом (2c).

Ампликон* — внехромосомная единица амплификации (образования копий участков ДНК).

Дополнительным подтверждением успешности совместной репликации плазмид стало образование колоний, устойчивых либо к зеоцину (pREP), либо к канамицину (плазмиды pLD и прРНК), либо к карбенициллину (pEFTu). Эти колонии стали результатом трансформации продуктов реакции PURErep, обработанных DpnI (2d).

Выбранные 26 клональных колоний с последующим анализом рестрикционных особенностей еще раз подтвердили успешность TTcDR всех шести плазмид (2e).

Используя тот же метод, что был описан ранее, ученые провели еще одну процедуру совместной репликации пяти дополнительных плазмид: гены системы минимальной регенерации нуклеозидтрифосфата на основе креатинкиназы (pCKM), аденилаткиназы (pAK1) и нуклеозиддифосфаткиназы (pNDK); а также T7-РНК-полимеразы (T7RNAP) и пирофосфатазы (pIPP).

Изображение №3
 
Изображение №3

При общем размере 116.3 т.п.н. данный набор из 11 плазмид достигает > 100% предполагаемой длины генома, предложенной для минимальной, самореплицирующейся системы, зависящей только от низкомолекулярных питательных веществ (3а).

Далее ученые решили проверить, может ли PURErep во время репликации обеспечивать параллельную экспрессию генов. Для этого была рассмотрена мультицистронная экспрессия ФТ, кодируемых на трех плазмидах pLD: pLD1, pLD2 и plD3 (не включая pEFTu).

Чтобы исследовать, способна ли PURErep в целом поддерживать мультицистронную экспрессию из этих плазмид, была проведена бесклеточная экспрессия из каждой отдельной плазмиды в присутствии BODIPY-Lys-tRNALys, что обеспечивает флуоресцентную маркировку продуктов трансляции.

Чтобы улучшить чувствительность обнаружения и дать возможность количественного определения вновь синтезированных белков, дополнительно был проведен количественный анализ экспрессии белка на основе масс-спектрометрии с использованием стабильных изотопных меток.

Изображение №4
 
Изображение №4

Данный анализ предоставил убедительные доказательства синтеза всех субъединиц ФТ белков, кодируемых pLD (4а). Также наблюдалась частичная или полная регенерация белков, кодируемых как в pLD2, так и в pLD3.

Анализ экспрессии показал, что даже в не модифицированной PURErep в сочетании с pREP наблюдается полная репликация 32 ФТ цидронов, кодируемых pLD, и экспрессия примерно половины кодированных пептидных цепей ФТ, число которых соответствует или превышает исходное.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном труде ученым удалось достичь того, о чем многие их коллеги ранее могли только мечтать — создать искусственную систему, которая способна само-реплицировать.

Утрировано говоря, это означает, что им удалось сделать первые шаги к созданию системы, которая будет самовоспроизводиться, тем самым максимально имитируя биологические процессы.

Авторы исследования крайне довольны результатами и планируют в будущем расширить искусственный геном дополнительными сегментами ДНК. Они хотят создать систему с оболочкой, способную сохранять жизнеспособность, впитывая питательные вещества и избавляясь от отходов. Подобная искусственная структура может быть использована в качестве специализированного производственного био-устройства для природных веществ или в качестве основы для создания еще более сложных систем.

Клонирование — процесс сложный, в чем нет сомнений, однако создание полноценной, жизнеспособной синтетической системы — совсем другой уровень. Кто-то скажет, что подобные исследования опасны, ибо никто не вправе брать на себя обязанности матушки-природы. Тем не менее, любопытство человека практически невозможно унять. Наше желание все понять и все повторить является одним из движущих фактором прогресса науки. Хорошо это или плохо — вопрос, на который нет однозначного ответа. Нам остается лишь восхищаться достижениями светлых умов и с опаской смотреть в будущее, одновременно надеясь на утопию.

Источник: https://habr.com/ru/company/ua-hosting/blog/489242/?utm_sour...

Популярное в

))}
Loading...
наверх